真核基因组被RNA聚合酶II (Pol II)广泛转录，除了mrna外，还产生许多长链非蛋白编码RNA (lncRNAs) (Kapranov et al .， 2002)。lncrna按其基因组来源进行分类，包括独立转录单元(大型介入非编码RNAs [lincRNAs]) (Guttman et al, 2009)、蛋白质编码基因上游区域(启动子上游转录本[prompt] [Preker et al, 2008])和增强子(增强子RNAs)。

lncrna的生物学意义备受争议(Palazzo & Lee, 2015;(i)有多少lncrna在功能上是相关的;(ii) lncrna的活动是什么;(iii)其潜在的机制是什么?据报道，lncRNA的功能包括许多转录本本身很重要的情况(例如，已有的已有或非现有的已有[Grote等，2013;在一些情况下，RNA产物是多余的，但是转录的行为(例如，Airn [Latos et al .， 2012])或潜在的DNA元素(例如，Bendr或Lockd [Engreitz et al .， 2016;Paralkar等人，2016])影响局部基因表达。

各种lncRNA类,lincRNAs与mrna最共同的属性,包括5′m7G帽,保利(a)的尾巴和监管的关键转录因子(格特曼等人,2009)。由于lincrna在细胞核中富集(相对于mrna) (Engreitz et al .， 2016)，主要被建议调节基因表达。这种调控可能发生在顺式基因(涉及相邻的基因组位点)或反式基因(涉及遥远的、无关联的靶基因)。LincRNAs在细胞类型之间表达差异很大(c比利希利等，2011)，许多LincRNAs已经被证明可以作为功能rna来帮助指定细胞类型(Guttman等，2009;格罗特等人，2013;Lin等人，2014;Leucci等人，2016)。另一方面，一些lincRNA基因可以作为DNA元素或通过转录而不需要RNA本身(Engreitz et al .， 2016;Ard等人，2017;Joung等人，2017)。支持,lincRNAs不如mrna有效拼接和3′末端形成的差异在某些方面(Mele等,2017;Schlackow等人，2017年)。此外，有报道认为lincrna的半衰期与mrna相似，并且在单个“头彩”细胞中高度表达，而另一些人则认为lincrna的稳定性较差，且表达量普遍较低，引发了RNA自身是否具有功能的争论(c比利希等，2015;Liu et al, 2016;Mele等人，2017;Schlackow等人，2017年)。因此，新方法必须确定哪些lincRNA基因在功能上是重要的，并通过转录或RNA产物来区分它们是否作为DNA元素起作用(Bassett et al .， 2014)。

目前有两种广泛的策略被用来寻找功能性的lincRNA基因。第一个基于基因或RNA产物的特性进行预测，包括组织或细胞类型特异性表达，与其他基因共同表达，进化保护，亚细胞定位，或RNA处理和稳定性(Guttman et al, 2010;Tuck & Tollervey, 2013;Necsulea等，2014;卡比利等人，2015)。第二种方法是通过靶向或大规模基因缺失，通过正向基因筛选来识别对特定表型重要的lincRNA基因(Sauvageau et al, 2013;Zhu等人，2016)，启动子缺失(Engreitz等人，2016)，聚(A)盒的整合提前终止转录(Latos等人，2012;(Engreitz et al .， 2016)，或CRISPR干扰或激活下调或上调转录(Joung et al .， 2017);Liu et al, 2017)。

识别功能性lincRNA基因的方法在效力和易用性方面都在迅速提高。例如，使用反义寡核苷酸(Leucci et al, 2016)或crisprs - cas13 (Abudayyeh et al, 2017;Cox等人，2017)现在可以有效抑制lincRNA表达，直接测试RNA产品的作用。这与以前的方法不同，如基因删除或CRISPR干扰，会改变DNA序列和/或转录，并遭受不可预知的后果，如新转录本的启动(Howe et al .， 2017)。尽管最近取得了这些进展，lincRNA敲除的效果可能是可变的，而且可能有非目标效应。因此，需要进一步改进这些方法，并测试其他策略，以获得快速、高效、寿命长且可逆的系统，以直接针对lincRNAs。

基于以上考虑，我们试图解决理解lincRNA基因功能的三个关键挑战(Bassett等人，2014):(我)来预测哪些lincRNA基因可能功能相关,(2)实验测试这些基因是否函数在顺式或反式和是否需要RNA产品,和(3)更广泛的评估lincRNA记录的属性,来帮助理解许多lincRNA基因产生功能的RNA,与多少可能不是函数作为DNA元素或通过转录。

为了实现这些目标，我们使用单细胞和大体积RNA测序对小鼠胚胎干细胞(mESCs)和衍生神经前体细胞(NPCs)进行了分析。我们发现lincRNA具有显著的细胞类型或亚种群特异性表达，并预测了功能相关的lincRNA基因。聚焦于16个最有前途的lincRNA基因，我们产生了这些基因位点被删除的细胞系。与此同时，我们开发了一种自我分裂的核糖酶方法来减少这些lincRNA转录本的表达，同时最小化对lincRNA基因(即，以测试RNA产品的功能)。总之，我们对140个细胞系的深入分析突出了两个关键方面。首先，尽管许多lincRNA基因在反式基因中起作用，我们预测多达三分之一的lincRNA基因位点在顺式基因中起调节邻近基因表达的作用。其次，这些局部lincRNA基因活性可能不需要RNA产物。为了进一步研究这一点，我们检查了lincRNA的性质。我们对核外泌体的转录范围直接靶点进行了分析，发现与mRNAs相比，大多数lincRNAs过早终止了转录(在其启动子的几百个核苷酸内)，并迅速成为降解的靶点。这些特性支持最近的观点，即功能性lincRNA基因可能通常作为DNA元素或通过转录而不需要RNA (Engreitz et al .， 2016;Paralkar等人，2016;Joung等人，2017)，并强调直接测试RNA产品的作用的重要性。

总之，我们的研究揭示了lincRNA和mRNA行为之间的关键差异，并为预测和实验测试lincRNA基因功能，特别是RNA产品的作用提供了全面的资源。