限制克隆的核心非常简单。你只需切开目标载体，用同样的酶插入，清理消化载体，插入，将两者连接在一起，将连接的载体转化成细菌，然后筛选。虽然每个步骤都正确可能有点麻烦，但在我看来，整个过程中最困难的部分是计划它。

如果您刚刚开始进行限制克隆，那么学习这个过程可能会有点困难，但这是可以的。我们是来帮忙的!学习任何东西最简单的方法就是这么做，所以我想我会一步一步地给你们介绍我做的最后一个克隆设置。它什么都有一点，所以它将涵盖你在克隆过程中遇到的大多数问题。

列出你有什么和你需要什么限制克隆

准确地写下你拥有的向量，你需要的组件，以及过程结束时需要的任何其他规定。一定要注意框架要求等内容。这看起来很简单，但却是规划过程中最重要的部分。

在我的克隆实验中，我需要删除我拥有的Cas9载体中的引导RNA序列，并用我合成的一组新序列替换它们。我知道我不需要担心任何在框架中的东西，因为那已经为我做了。我还知道新的指南正在合成，并以标准向量pUC19发送给我。

在计算机屏幕上拉出你的目标向量，期望插入，和其他DNA序列

首先要做的是在你选择的程序中打开你的序列文件。我使用SnapGene，但是有很多程序都有这些功能。

载体由原载体、表达Cas9的植物泛素启动子、选择基因和各种质粒维持基因组成。我只关心移除旧的引导RNA序列，并用我设计的序列替换它们:

找到兼容的限制站点

为了使限制克隆起作用，你需要找到能够同时切断目标载体和进入的DNA的酶，所以你需要检查被切断的位点。对于许多克隆实验来说，这可能很复杂。重要的是要考虑酶在载体中切了多少次，留下的悬垂物，以及酶识别位点的类型。如果可能的话,使用酶只切一次在一个向量,把粘性逼近(即5′和3′DNA悬臂),和有简单识别网站(通常6 - 8碱基对网站)。试着让这个过程尽可能的简单，这样实际的克隆也会很容易。如果你现在就花时间仔细地计划，那么它最终总会有回报的。

在我的克隆实验中，我首先绘制了我的载体上的各种酶位点。

这就是我开始遇到问题的地方。如你所见，在老的引导RNA和启动子之间没有任何切割点。如果这种事发生在你身上，别担心!对于这类问题，几乎总是有创造性的解决方案。在我的例子中，我注意到虽然我不能自己移除引导序列，但我可以移除引导序列和启动子。因为这是我实验室里常用的启动子，我知道我可以把它从我手头的另一个质粒中添加回来。

其他一些常见问题和变通方法:

目标和插入物之间没有共同的酶:这是你可能遇到的最常见的问题。

以酶悬架为例:有些酶具有共同的悬架，可以一起使用，尽管它们不是相同的识别序列，例如BamHI和BglII。

可以考虑填补一个悬垂物:虽然不是很理想，但T4 DNA聚合酶或Klenow的短期治疗可以填补一个粘性悬垂物，使其变钝。钝头总是兼容的，所以总是可以一起工作。如果你必须使用一个钝点，试着只在切割的一边使用它，这样方向仍然是保守的。

添加带PCR的切割点:如果你已经通过PCR放大插入物，这个选项是最好的。在订购时，只需将识别点添加到引物的末尾即可。确保在底漆结束前添加一些额外的底漆以提高切割效率。PCR完成后，结扎前先消化。

插入不会在帧中

如果通过PCR扩增，在引物中加入碱基，以确保帧的完整性。

考虑克隆成具有不同切割位点的中间载体。

用PCR扩增靶的引物，在镜框中加入切割点。

这种酶切过多次

这是可以的，这取决于您使用的是什么。无论如何，如果DNA从质粒中被移除，只要它不在目标之内，那就没问题。只要确保你知道需要提取的波段大小就可以了。

解决任何问题

在我的克隆实验中，我需要用相同的启动子替换一个启动子。另外，由于我将使用的酶之一是PmeI，一种钝端切酶，我需要确保我包含了两个新的粘稠悬垂限制切位点来插入我的新的引导rna，以使克隆更容易。这在PCR中很容易做到。我只需要找到另一个载体中的启动子:

不幸的是，我所拥有的任何一个都无法完美地与我需要的裁剪站点配合。我用PCR解决了这个问题。我知道我的引导RNA序列很可能会在pUC19中被表达，所以我设计了PCR，加入了与我的新合成产物相匹配的酶。通过设计带有限制性位点的引物，可以在几乎任何PCR产物的末端添加酶切位点。像这样:

在这种情况下，引物的悬垂部分会增加PacI限制性内切酶的位点，加上一些额外的碱基，使酶能够抓住。

所以在我的克隆项目中，我设计了引物将PacI和AvrII添加到我的产品末尾:

PCR后我可以用AvrII消化PCR产物，用PmeI和AvrII消化质粒。PCR产物的一端(未切割的一侧)将与钝端PmeI位点相匹配，另一端与AvrII留下的悬垂相匹配。克隆反应结果为:

完美!我的老向导走了，我的发起人回来了!

检查以确保你在正确的轨道上

在这一点上，回到你开始列出的清单，确保你没有忘记任何重要的事情。当你在不同的切割场地之间来回切换的时候，你很容易就会忘记框架之类的东西。回顾你的清单，确保一切都在正轨上。如果你因为一些意想不到的事情而不得不调整你的计划，不要惊讶。好消息是你现在可以在硅中找到这些问题，而不是在你做克隆实验的时候去弄清楚它们。

清洗和重复的

在这一点上，你做的步骤和以前一样，直到整个实验计划出来。对于我的实验，我现在需要计划如何将引导RNA插入到我的新载体Cas9中。正如你在上面看到的，我只需要用PacI和HindIII侧翼引导，就可以轻松地在泛素启动子之前插入它们。

我正在合成我的插入物，我知道公司会把合成的DNA插入到一个载体中，然后把它运送给我。结果，我找到了一个中间载体，让他们把合成的DNA插入到已经有我需要的位置，从而节省了一些钱。我尝试了几种不同的方法，终于找到了一种行之有效的方法。

指南被插入到pUC19的MCS中，这意味着我现在可以用HindIII和PacI把它们剪掉。由于HindIII和PacI是我的Cas9载体中已经留下的酶，克隆实验非常简单，只是简单的剪切和粘贴。最后，我得到了最终的结果

确认这是你想要的

现在您已经计划好了，确保您满足了最初的所有需求。我知道我一直在提醒你什么是显而易见的，但它来自真实的经验。由于计划一个多步骤克隆实验涉及到复杂的问题，你真的会失去一些次要需求的焦点。

记录您的限制克隆计划

既然已经有了限制克隆计划，那么就记录下来。保存文件，并按顺序写下所需的每个组件。SnapGene打印了一份历史总结，我通常把它挂在我的实验台上，以便在我工作的时候记录下每一件事情。如果你的程序没有类似的东西，我建议你自己做一个。写下您将使用酶在每个步骤中,乐队的大小应该是,特定的乐队你想提取如果做凝胶萃取,等等。我也喜欢列出我可以使用的引物的序列验证而我文件在电脑上。这样我就能在一个地方得到我需要的所有信息。

计划限制克隆实验的关键是考虑你所有的选择。通常情况下，你被可用的酶或可靠的引物结合位点限制，你需要改变你原来的计划。关键是不要立即气馁，并考虑一下你还有什么其他的选择。记住，当你在湿板凳上的时候，仍然会出现一些问题，但是在大多数情况下，计划是战斗的一半。好运!