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肉毒杆菌为革兰阳性粗短杆菌，有鞭毛、无荚膜、产芽孢。芽孢呈椭圆形，比繁殖体宽，位于次极端，使细胞呈网球拍状。

在普通固体培养基上，形成类圆形菌落，表面呈半透明、颗粒状、边缘不整齐、向外扩散、呈绒毛网状，且常常扩散成菌苔。在血平板上，出现与菌落几乎等大或者较大的溶血环。在卵黄琼脂培养基上，可产生脂酶，在菌落表面入周围形成彩虹薄层。